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本拓扑异构酶来源于牛痘病毒，通过基因重组方案制备纯化。该TOPO酶能解旋DNA的超螺旋结构，此外还能识别并切割双链DNA末端[5'C(T)CCTT]，并且与DNA形成共价连接形成稳定复合物。该共价复合物遇到DNA的5'-OH基团后，重新连接形成完整DNA链。因此，该TOPO酶可作为DNA连接的有效工具酶，用于DNA的载体连接（TOPO克隆载体制备）、接头连接（NGS建库）等实验。

• DNA-载体连接（TOPO载体制备）
  
• 接头连接（NGS建库）

• Vaccinia Topoisomerase催化含有CCCTT末端片段的连接和共价交联反应：
  
  图1.在10μL反应体系中，4pmol的A接头和含5'OH的B接头连接，两接头间含有8bp的互补碱基，37℃反应10min后，在12% TBE-PAGE-尿素胶中电泳。结果显示TOPO有效的共价交联A接头，并催化两片段连接。
  
• Vaccinia Topoisomerase催化超螺旋质粒缺刻反应：
  
  图2.在10μL体系中，加入0.5μg的超螺旋质粒DNA，加入不同量的TOPO酶，37℃孵育5min。结果显示TOPO酶快速的使超螺旋DNA开环。

• 质粒解旋
  
  • 按下表加入各成分配制质粒解旋反应体系
    

    成分	用量
    10×TOPO Buffer	2.5μL
    超螺旋质粒DNA	1～20μg
    Vaccinia TOPO (5pmol/μL)	1μL
    ddH2O	至25μL

  • 37℃孵育5～15min。
• 接头连接：
  
  • 按下表加入各成分配制接头连接反应体系
    

    成分	用量
    10×TOPO Buffer	2.5μL
    2M NaCl	2.5μL
    接头A(含CCCTT)	5-100pmol
    接头B(含5'OH)	5-100pmol
    Vaccinia TOPO (5pmol/μl)	1μL
    ddH2O	至25μL

    • 双链接头A通常5'做NH2封闭修饰，以防止自连接；接头A的CCCTT后通常包含5～12bp尾巴，再长的尾巴会导致连接效率大幅下降；
      
    • 双链接头B的5'端必须包含-OH。
  • 37℃孵育5～15min。